سل تايپ و بک تايپ

مقدمه

علم سرولوژی گروه خونی در سال 1900 با کشف گروههای خونی ABO توسط لنداشتاینر پا به عرصه ظهور نهاد . همراه با توسعه ضد انعقادها، کشف گروههای خونی عمل تزریق خون را امکان پذیر نمود . لنداشتاینر سرم و گلبولهای قرمز افراد مختلف را با هم مخلوط نمود و دریافت که در برخی آزمایشات گلبولها آگلوتینه ( کلامپ ) می شوند و در برخی دیگر آگلوتینه  نمی شوند که بیانگر تغییرات فردی می باشند. مخلوط کردن سرم یا حداقل آنتی بادیها ، با گلبولهای قرمز و متعاقبا بررسی وجود یا عدم وجود آگلوتیناسیون ،پایه اکثر روش های تعیین فنوتیپ گروه خونی مورد استفاده امروزی است . تا سال 1910 ثابت شده بود که گروههای خونی ABO صفات ارثی هستند ،در طی سال 1950 ثابت شد که گروههای خونی حاکی از زنجیره های الیگوساکاریدی بر سطح گلیکو پروتئین ها و گلیکو لیپیدها هستند و در سال 1990 ژنی که آنزیم های مسئول تولید آنتی ژن های ABO را رمز دهی می کند کلون گردید .

ABO یک سیستم گروه خونی تلقی می گردد زیرا برسطح گلبولهای قرمز کشف گردید و آنتی ژنهای آن با استفاده از تکنیک های هماگلوتیناسیون به راحتی بر سطح گلبولهای قرمز شناسایی می شوند . در هر حال این آنتی ژنها در بسیاری از  بافت ها و اندام ها و به شکل محلول در ترشحات نیز وجود دارند و به همین دلیل غالبا آنتی ژنهای گروه بافتی –خونی نامیده می شوند.

تهیه و نگهداری نمونه خون بیمار

برای انجام آزمون سازگاری ، نمونه سرم یا پلاسما مورد استفاده قرار میگیرد. مراکز انتقال خون معمولا سرم را ترجیح می دهند . انتخاب سرم یا پلاسما جهت تعیین آنتی بادی های وابسته به کمپلمان، دارای معایب و فوایدی می باشد . هنگامی که پلاسما مورد استفاده قرار می گیرد، ضد انعقادهایی نظیر EDTA یا سیترات ، کلسیم را از محیط خارج کرده و مانع فعالیت کمپلمان
می شود . بنابراین برای تعیین آنتی بادیهایی که فقط از طریق فعال کردن کمپلمان مشخص
می شوند ، باید سرم تازه را مورد استفاده قرار داد .

برای حفظ میزان مناسب کمپلمان ، باید فورا سرم را از لخته جدا کرده و آن را در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری نمود .

از به کار بردن نمونه های دارای همولیز باید پرهیز کرد . چنانچه همولیز ناشی از دریافت خون باشد ، ممکن است با همولیز ناشی از آنتی بادی لیز کننده که با گلبولهای قرمز آنتی زن مثبت واکنش می دهند اشتباه شود .

انتی بادیهایی که توانایی ایجاد همولیز را دارند بیشتر در سیستم های خونی ABO،Lewisو Kidd مشاهده می شوند . چنانچه به کار بردن یک نمونه همولیزشده اجتناب ناپذیر باشد مقایسه بین اندازه سلولهای باقی مانده بعد از انجام آزمایش در مقایسه با اتو کنترل ضروری می باشد .

برای اجتناب از الودگی نمونه با مایعات تزریقی ، نمونه های وریدی را نباید بالاتر از محل تزریق مایعات درون رگی تهیه نمود ولی میتوان پایینتر از محل تزریق یا ترجیحا از بازوی دیگر بیمار نمونه گیری کرد .

ابزار ، معرفها و کنترل کیفی

در آزمایشات ایمونوهماتولوژی از لوله های باریک (75×12 میلی لیتر یا 100×17 میلی لیتری) استفاده می شود که مزیت آن برسایر لوله های ارتفاع بیشتر نمونه ، کاهش تبخیر سطحی ، تسهیل در ایجاد آگلوتیناسیون می باشد .

در صورت استفاده از پیپت پاستور ، جهت تداوم در اندازه قطرات باید در تمام مراحل آزمایش ، از یک پی پت خاص استفاده شود که جهت زدودن معرفهای قبلی آنرا حداقل دو بار توسط آب و یکبار با سرم فیزیو لوژی شستشو دهند .

آنتی سرمهایی که در بانک خون مورد استفاده قرار می گیرند به طور معمول در یخچال نگهداری میشوند و در دمای اتاق قدرت خود را از دست می دهند . لکتین و آنتی سرمها در اثر آلودگی و حرارت ،قدرت (potency ) و اثر اختصاصی(specificity ) خود را از دست می دهند .

این آنتی سرمها باید روزانه از نظر تغییر رنگ ،کدورت ،واکنش آگلوتیناسیون قوی با سلولهای Aو B مشخص واکنش منفی با سلولهای O مشخص کنترل شوند .

کنترل آنتی هیومن با استفاده از گلبولهای قرمز حساس و سلولهای کنترل مثبت و منفی صورت می گیرد .

تعیین گروه سلولی Cell type

1.چهار عددلوله را به نامآنتی Rh -آنتی سرم A - آنتی سرم B وآلبومینآماده و در هر کدام یک قطره از آنتی سرم مربوطه و آلبومین ریخته شود.

2. در هر یک از لوله ها یک قطره از سوسپانسیون 5-3% گلبول قرمز اهدا کننده را اضافه نمائید .

نمونه خون میتواند به صورت لخته یا در ماده ضد انعقاد جمع آوری شده باشد .برای تهیه رقت 5- 3 % نمونه را سه بار با سرم فیزیولوژی شستشو داده و در نهایت مقداری سرم فیزیولوژی اضافه گردد تا گلبول قرمز به رقت  5-3% برسد . برای تائید رقت سوسپانسیون میتوان از دستگاه میکرو هماتوکریت استفاده کرد. (یا رنگ قرمز متمایل به صورتی )

3. لوله ها را به آرامی تکان دهید . سپس به مدت 30 ثانیه با دور 1000-900 دور در دقیقه (1000g ) سانتریفوژ نمایید یا60دقیقه در دمای اتاق انکوبه نمایید. ( ترجیحا با استفاده از سروفیوژ )

4. لوله ها را در مقابل نور از نظرآگلوتیناسیون بررسی کنید .

هرگونه آگلوتیناسیون یا همولیز موید واکنش مثبت می باشد در غیر اینصورت واکنش منفی بوده که باید حتما از نظر میکروسکوپی نیز کنترل شود .

نکته : در روش سل تایپ همیشه ابتدا آنتی سرم ها داخل لوله ها ریخته شود و سپس کلیه لوله ها از نظر ریختن آنتی سرم ها کنترل گردد .

تعیین گروه سرمی Back type

1. دو عدد لوله را به صورت A و B مشخص کنید

2. یک قطره سرم بیمار را در هردو لوله بریزید . لوله ها باید از نظر ریختن سرم کنترل شوند.

3. یک قطره از سوسپانسیون A1cell و B cell  را جداگانه در لوله های مربوط اضافه نمایید

سوسپانسیون A1cell : مخلوطی از گلبولهای قرمز حداقل4-3 فرد با گروه خونی A می باشد .

سوسپانسیون B cell  : مخلوطی از گلبول قرمز حداقل4-3 فرد با گروه خونی B  می باشد .

4. سوسپانسیون گلبول A1 و B توسط پرسنل گروهبندی تهیه می شوند .

5. به آرامی محتویات لوله ها را مخلوط کنید و سپس به مدت 30 ثانیه در دور rpm1000-900با سروفیوژ سانتریفیوژ کنیدیا در دمای اتاق 60دقیقه انکوبه کنید .

6. لوله ها را در مقابل نور به ملایمت تکان داده و از نظر آگلوتیناسیون بررسی نمایئد .

7. در صورت هماهنگی و همخوانی بین Cell و Back نتیجه گروه خون را میتوان گزارش نمود .

آزمایش DU

در مواردیکه نتایج حاصل از آزمایش RH منفی است و نیز در واکنش های ضعیف میکروسکوپی به آزمایش DU مبادرت می شود .

روش آزمایش :

1- یک قطره از آنتی سرم D و یک قطره از سوسپانسیون 5- 3 درصد از گلبولهای قرمز بیمار را در یک لوله آزمایش ریخته و مخلوط نمائید .

2- لوله را به مدت 60- 40 دقیقه در بن ماری 37 درجه سانتی گراد قرار دهید .

3- پس از خاتمه زمان مذکور ، لوله را سه مرتبه با سرم فیزیولوژی شستشو داده و بار آخر محلول رویی را خالی کرده و یک قطره آنتی هیومن به آن اضافه کنید و 30ثانیه در دور RPM 3400 سانتریفوژ کنید.

4 – لوله را در مقابل نور به ملایمت تکان داده و از نظر آگلوتیناسیون بررسی کنید.موارد منفی را با میکروسکپ کنترل نمائید . نتایج منفی را میتوان با استفاده از گلبول قرمز حساس شده تائید نمود.

در ایمونوهماتولوژی واکنش آنتی ژن - آنتی بادی از طریق آگلوتیناسیون گلبولهای قرمز مشخص می شود . در این سیستم قراردادی از مقیاس Weakly تا 4+ استفاده می شود .

I            ⁺4یک توده بزرگ آگلوتینه از گلبول قرمز در ته لوله ایجاد می شود و مایع رویی کاملا شفاف و بدون سلول

II            ⁺3یک توده بزرگ آگلوتینه از گلبولهای قرمز در ته لوله تشکیل میشود. گلبول آزاد مشاهده میشود.

III            ⁺2تعداد متعددی از توده های با اندازه متوسط حاصل از آگلوتیناسیون گلبولهای قرمز در ته لوله است.مایع رویی شفاف است.

IV            ⁺1تعداد زیادی توده های با اندازه متوسط و کوچک در ته لوله و مایع رویی کدر و گلبول های آزاد فراوان

V            W⁺تعداد فراوان توده های کوچک سلولی که به صورت میکروسکوپی مشاهده
می شود

VI            منفیگلبولهای قرمز آگلوتینه نشده به صورت آزاد قابل مشاهده است.

VII            MFآگلوتیناسیون مخلوط mixed field   ، بخشی از گلبولهای قرمز آگلوتینه وبخشی آزاد مشاهده میشوند.

 

 

 

 

تفسیر نتایج گروهبندی سلولی و سرمی

Result	Back type		Cell type
	B.Cell	A1.Cell	Anti D	Anti B	Anti A
A+	4+	-	4+	-	4+
A-	4+	-	-	-	4+
B+	-	4+	4+	4+	-
B-	-	4+	-	4+	-
AB+	-	-	4+	4+	4+
AB-	-	-	-	4+	4+
O+	4+	4+	4+	-	-
O-	4+	4+	-	-	-

در صورتیکه نتایج Cell type و Back type همخوانی نداشته باشند ابتدا باید آزمایش تکرار و در مرحله بعد تکرار نمونه گیری و انجام مجدد آزمایش است .

 

اشکالات و علل بروز خطا در گروهبندی ABO

عوامل بروز خطا در گروهبندی سیستم ABO به دو بخش عمده تقسیم می شوند:

الف- عوامل مرتبط با آنتی ژن یا آنتی بادی

ب- عوامل تکنیکی

الف- عوامل مرتبط با آنتی ژن یا آنتی بادی

این عوامل شامل 4 گروه اصلی زیر می باشد :

1. کاهش و یا فقدان ایزو آگلوتینین

کاهش یا فقدان آنتی کرهای گروه خونی در گروهبندی سرمی منعکس شده که علل عمده آن عبارتند از :

• · ضعف یا نقصان طبیعی آنتی کرهای گروه خونی ، در نوزادان(قبل از شش ماه ) و افراد مسن و نیز افراد مبتلا به دیس پروتئینمی و هیپوگاماگلبولینمی ( لوسمی ها و لنفوم )
• · بیماران مبتلا به نقص سیستم ایمنی ، انجام شیمی درمانی و استفاده از داروهای مهارکننده ایمنی
• · کیمریسم : مخلوط دو نوع مختلف از گلبولهای قرمز در یک فرد که بدنبال تزریق خون قبلی ،تعویض خون نوزادان ، انتقال خون جنین به مادر هنگام زایمان و پیوند مغز استخوان و انواع نادر ارثی پدید می آید.

2. تضعیف یا فقدان آنتی ژنهای گروه خونی

• تضعیف یا فقدان آنتی ژنهای A یا B و یا هردو از عوامل دیگر ناهماهنگی در گروهبندی سلولی و سرمی به شمار می رود که در گروهبندی سلولی منعکس می شود و علل عمده آن عبارتند از :
• تغییرات کمی و کیفی آنتی ژن در لوسمی ها و تومورهای بدخیم
• غلظت بالای آنتی ژنهای محلول در سرم (A، B)در بیماریهایی مثل کارسینوم معده وپانکراس
• گروههای فرعی A وB

3. واکنشهای غیر منتظره در گروهبندی مستقیم

• تغییر ماهیت گلبولهای قرمز توسط آنزیم های باکتریایی(aquired B Antigen )
• پلیآگلوتیناسیون(ظاهر شدن آنتی ژن مخفی T در عفونتهای باکتریایی و آگلوتیناسیون گلبولهای قرمز با سرم تمامی افراد)
• آنتی کر ضد Acriflavin (ماده رنگین در آنتی سرم B ) که موجب آگلوتیناسیون کاذب با گلبولهای قرمز B می شود .

4. واکنشهای غیرمنتظره در گروهبندی معکوس

• وجود آنتی بادی های مختلف
• تشکیل رولو
• آنتی بادی ضد دارو

ب- عوامل تکنیکی ایجاد خطا در گروهبندی سیستم ABO

شایعترین علت بروز خطا و ایجاد ناهماهنگی در گروهبندی سلولی و سرمی را عوامل تکنیکی تشکیل می دهند که رایج ترین آنها عبارتند از:

1.آلودگی ابزار( لوله ،پی پت و غیره) معرف ها ( آنتی سرم و سوسپانسیون سلولی) که واکنش های مثبت و منفی کاذب را به همراه دارند .

2. عدم تناسب سرم یا آنتی سرم با سوسپانسیون سلولی ( واکنش منفی کاذب)

3.عدم توجه به وجود همولیز ( منفی کاذب )

4. تضعیف یا کاهش تیتر آنتی سرم و کهنه بودن سوسپانسیون سلولی که واکنش منفی کاذب به همراه دارند.

5. اشتباهات پرسنل در تعیین هویت بیمار یا معرفها ، عدم استفاده از میکروسکوپ در تایید نتایج منفی .

منابع:

1. کتاب راهنمای اساسی گروههای خونی    نویسنده: جف دنیلز– مترجم: جهانگیر عبدی

2. جزوه آموزشی  شماره 73 سازمان انتقال خون ایران

3. SOP های سازمان انتقال خون

 

گرد آورندگان : آزیتا فرشید -  ناصر نظری

زیر نظر: محسن طاهری سرپرست آزمایشگاه های انتقال خون خراسان رضوی